食品（乳粉）中维生素K2的测定

摘要：本文建立了食品（乳粉）中维生素K2的HPLC测定方法。参照新国标GB5009.290-2023中色谱条 件并优化，采用色谱柱ShimNex CS C18分析食品（乳粉）中维生素K2，结果显示，三个目标物MK-4、MK-7、MK-9峰型对称，与相邻杂质峰基线分离，满足日常检测需求。此方法可为食品（乳粉）中维生素K2的检测提供参考。
关键词：食品 乳粉 维生素K2 ShimNex CS C18 HPLC
 

1. 实验部分
1.1 实验仪器及耗材

Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪；
色谱柱：ShimNex CS C18（5 μm，4.6×150mm；P/N：380-01230-02）；
锌粉还原柱（4.6×50 mm）；
纯水机： PR-FP-0120α-MT1（ + 60L 水箱 + 取水器）；
SHIMSEN Disc HPTFE 针式过滤器（ P/N： 380-00341）；
LC/MS认证样品瓶LabTotal Vial（P/N：227-34001-01）；

SHIMSEN Pipet移液枪：SHIMSEN Pipet PMII-10（P/N：380-00751-02）；
SHIMSEN Pipet PMII-100（P/N：380-00751-04）；
SHIMSEN Pipet PMII-1000（P/N：380-00751-06）。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准中间溶液

MK-4和MK-7混合标准中间溶液（10μg/mL）：分别称取MK-4、MK-7标准品适量，用二氯甲烷甲醇溶液（10：90，V/V）溶解并稀释配制成10 μg/mL混合标准中间溶液。MK-9标准中间溶液（50μg/mL）：称取MK-9标准品适量，用二氯甲烷甲醇溶液（10：90，V/V）溶解并稀释配制成5 μg/mL标准中间溶液。

1.2.2标准工作溶液

分别准确吸取MK-4、MK-7混合标准中间溶液0.025mL、1.0mL于10mL容量瓶中，准确吸取MK-9标准中间溶液0.010mL、0.20mL于上述10mL容量瓶中，用流动相A定容至刻度，混匀。得到MK-4、MK-7标准工作溶液质量浓度分别为0.025μg/mL、1.0μg/mL，MK-9标准工作溶液质量浓度分别为0.050μg/mL、1.0μg/mL。临用现配。

1.3 试样处理

1.3.1 酶解

称取混匀后的乳粉试样50 g（精确至0.1 g）至250mL烧杯中，加入100mL水，充分混匀溶解；准确称取制备后的溶液6 g（精确至0.001 g）于50mL离心管中加入水11mL，再加入磷酸盐缓冲液（取54.0 g磷酸二氢钾于500mL烧杯中用300mL水溶解，用400 g/L氢氧化钾溶液调节pH至8.00，转移至500mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀）5mL，混匀，于50 ℃水浴超声5 min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.5 g，再加淀粉酶0.2 g，加盖，涡旋2 min，混匀后，置于37℃恒温水浴锅中酶解3h（每30 min涡旋1 min）使其充分酶解。

1.3.2 提取

取出酶解好的试样，分别加入10mL无水乙醇及1.0 g碳酸钾，混匀后加入10mL正已烷，涡旋2min，以6000r/min离心5 min，转移上清液至100mL旋蒸瓶中。

1.3.3 浓缩

将上述正已烷提取液于40℃水浴旋蒸至干，用5.0mL流动相A充分溶解浓缩物，将此溶解液用0.22 um滤膜过滤，此滤液为制备的试样溶液。

1.4 分析条件

色谱柱：ShimNex CS C18（5 μm，4.6×150mm；P/N：380-01230-02）
锌粉还原柱（4.6×50 mm）：此锌粉还原柱连接于色谱柱后；
柱温：30℃
荧光检测器：激发波长326nm，发射波长410nm
流速：1.0mL/min
进样量：20µL
流动相：A：量取900mL甲醇、100mL氯甲烷与1000mL烧杯中，加入1.5 g氯化锌、0.5 g无水乙酸钠，0.3mL冰醋酸，混匀。 B：二氯甲烷。A：B=95：5

2. 实验结果

按照上述色谱条件（1.4）进行采集，混合标准溶液和试样溶液色谱图如下：
混合标准工作溶液（1.0μg/mL）

混合标准工作溶液(MK-4、MK-7浓度为0.025μg/mL，MK-9浓度为0.05μg/mL)

试样溶液

重现性
混合标准工作溶液（1.0μg/mL）重现性

试样溶液重现性

3. 结论

本文建立了食品（乳粉）中维生素K2的HPLC测定方法。参照新国标GB5009.290-2023中色谱条件，采用色谱柱ShimNex CS C18分析食品（乳粉）中维生素K2，结果显示，三个目标物MK-4、MK-7、MK-9峰形对称，与相邻杂质峰基线分离，满足日常检测需求。此方法可为食品（乳粉）中维生素K2的检测提供参考。

4. 备注

低浓度混合标准品和试样溶液的色谱峰拖尾是因为锌粉还原柱导致的，与色谱柱无关。